Trong cuộc chiến chống đại dịch COVID-19, chúng ta đã rất quen thuộc với vũ khí vaccine mà một trong số đó, nổi bật nhất là vaccine mRNA. mRNA với khả năng tóm lược chức năng của mRNA trưởng thành đã cho thấy tiềm năng khai phá trong một loạt ứng dụng sinh học dược phẩm. Các phương pháp trị liệu hiện nay được nghiên cứu bao gồm đưa mRNA vào in vivo để thay thế protein, kích hoạt tế bào gốc, hoặc trị liệu miễn dịch ung thư. Gần đây nhất, các ứng dụng dược phẩm quan trọng với cách tiếp cận mới như vaccine chống lại các bệnh truyền nhiễm, hay vaccine mRNA bảo vệ chống lại SARS-CoV-2 đã nhận được rất nhiều sự quan tâm. Bài viết dưới đây của chúng tôi sẽ giúp bạn có cái nhìn tổng quát về công nghệ mRNA tổng hợp thú vị này nhé!
Vaccine mRNA hay RNA thông tin (messenger RNA-mRNA) bắt nguồn từ trung tâm luận thuyết (central dogma) rằng mRNA mã hóa protein. Phương thức vaccine đơn giản này tạo ra phản ứng miễn dịch thông qua việc cung cấp yếu tố di truyền mã hóa tất cả hoặc một phần của protein kháng nguyên dưới dạng phân tử sẵn sàng dịch mã. mRNA mã hóa kháng nguyên đích sẽ được các tế bào trình diện kháng nguyên (antigen-presenting cells) tiếp nhận và được dịch mã thành protein cuả mầm bệnh đích, từ đó tạo ra phản ứng miễn dịch. Cách tiếp cận này mô phỏng chặt chẽ quá trình tự nhiên mà virus lây nhiễm vào tế bào.
Nhìn chung, vaccine mRNA được sản xuất tổng hợp in vitro thông qua quá trình enzyme hóa. Việc phát triển và sản xuất vaccine mRNA là một quá trình tương đối đơn giản khi so sánh với các phương thức truyền thống, và có thể thu được kết quả sau một thời gian ngắn. Đặc điểm này khiến chúng phù hợp để phát triển nhanh với quy mô lớn, và cho đến nay đã được chứng minh là đóng vai trò quan trọng trong tình huống khẩn cấp của sức khỏe cộng đồng. Những đổi mới trong thiết kế và công thức vaccine mRNA giúp tăng khả năng ổn nhiệt để vaccine không yêu cầu phân phối theo dây chuyền lạnh, giúp giảm chi phí sản xuất và nâng cao khả năng tiếp cận toàn cầu.
Trong thiết kế vaccine mRNA, quá trình phiên mã in vitro từ khuôn mẫu plasmid DNA (pDNA) thường được sử dụng để tạo ra mRNA tổng hợp chức năng. Vector plasmid thường chứa các yếu tố sau: trình tự promoter khởi đầu ngược dòng, nhận biết duy nhất bởi polymerase T7, SP6 hoặc T3, tất cả đều có nguồn gốc từ thực khuẩn; 5’ UTR, cDNA, 3’ UTR, chuỗi đuôi poly-A xuôi dòng, và một vị trí cắt duy nhất trên đuôi poly-A xuôi dòng.
Hình 1. Quá trình tạo plasmid để phiên mã in vitro (IVT). Sau quá trình tổng hợp gene, sử dụng vector plasmid (pDNA) để nhân bản DNA đích. pDNA được nhân lên qua việc nuôi cấy vi khuẩn, sau đó tinh sạch sử dụng phương pháp tinh sạch acid nucleic, như dùng màng silica trong cột.
RNA polymerase của thực khuẩn bào thường được sử dụng để phiên mã chuỗi pDNA tuyến tính. Đầu tiên, pDNA được tuyến tính hóa với enzyme cắt giới hạn duy nhất đã chọn. Sau khi xử lý, chuỗi pDNA đã tuyến tính hóa sẽ được tinh sạch bằng phương pháp phenol-chloroform và tủa bằng ethanol. Với việc tinh sạch pDNA lượng nhỏ, có thể dùng bộ kit GenElute™ mRNA Miniprep kit. Với lượng tinh sạch lớn, nên sử dụng bộ lọc dòng tiếp tuyến (tangential flow filtration-TFF) do dễ dàng nâng cấp.
Sau bước tuyến tính hóa, việc phiên mã in vitro và đóng nắp sẽ được thực hiện trong dung dịch hỗn hợp gồm RNA polymerase tái tổ hợp (T7, T3 hoặc SP6) và nucleoside triphosphates, kèm nắp analog như CleanCap® Reagent hoặc ARCA-Anti-Reverse Can Analog (Cap Analog chống đảo ngược). Nucleoside đã biến đổi như N1-Methylpseudouridine-5′-Triphosphate (N1-Methylpseudo-UTP, 1-Methylpseudo-UTP) có thể được sử dụng thay GTP để ức chế hệ thống miễn dịch bẩm sinh, và thường được sử dụng trong các vaccine mRNA hiện nay.
Hiệu quả đóng nắp mRNA với ARCA trung bình vào khoảng 70-80% do chúng cạnh tranh với GTP, trong khi lượng mRNA bị giảm tới ¼ so với tổng hợp mRNA tiêu chuẩn. Trong khi đó, hóa chất CleanCap® Reagent đã được chứng minh là hoạt động với hiệu suất đóng nắp 94% mà không ảnh hưởng tới năng suất sản lượng mRNA.
Ngoài ra, việc đóng nắp có thể đạt được bằng cách thực hiện phiên mã mà không có nắp analog, thay vào đó sử dụng phức hợp đóng nắp được mã hóa bởi virus vaccinia (enzyme đóng nắp, 2′-O-Methyltransferase, GTP, and S-adenosyl methionine (SAM)). Hiệu quả đóng nắp sẽ khác nhau tùy thuộc vào cấu trúc thứ cấp của mRNA quan tâm. Cuối cùng, khi chiều dài đuôi poly A của khuôn pDNA không đủ (lên đến 150 base), nó có thể được kéo dài sử dụng enzyme poly A.
Hình 2. Tổng hợp mRNA được hoàn thiện bằng tuyến tính hóa pDNA, phiên mã mRNA in vitro (IVT) sử dụng phương pháp không dùng tế bào, và đóng nắp mRNA sử dụng nắp analog hoặc phức hợp nắp mã hóa bởi virus.
Bước đầu tiên trong tinh sạch mRNA là loại bỏ khuôn pDNA tuyến tính bằng cách sử dụng deoxyribonuclease, hoặc DNase. mRNA sau đó được tủa với lithium chloride (LiCl), và rửa với 75% ethanol. Tủa mRNA thu được có thể được hòa lại với nước hoặc đệm phục hồi. Tuy nhiên, phương pháp kết tửa này nên tránh sử dụng khi mở rộng, với 2 lý do, vì khó mở rộng quy mô, và do một số hóa chất độc hại cần tránh theo quy định sản xuất GMP. Khuyến cáo nên sử dụng GenElute™ mRNA Miniprep Kit với quá trình tinh sạch lượng nhỏ. Ở quy trình lớn, có thể thực hiện lọc dòng tiếp tuyến (tangential flow filtration-TFF) bằng cách sử dụng Pellicon® Cassettes, và có thể được nâng cấp kiểu tuyến tính.
RNA sợi đôi (dsRNA-double stranded RNA), một sản phẩm phụ của phiên mã, là yếu tố nhiễm chính trong tổng hợp mRNA. dsRNA có thể kích thích đáp ứng miễn dịch bẩm sinh, mà từ đó làm giảm sự phiên mã của mRNA đã đưa vào. Do đó, khi tổng hợp mRNA trong phát triển vaccine, dsRNA nên được loại bỏ. Phương pháp tinh sạch cellulose sử dụng sợi cellulose fibers có thể được dùng để loại bỏ dsRNA ở bất kỳ quy mô nào.
Tham khảo thêm thông tin tại đây: mRNA Synthesis for the Development of Vaccines and Therapeutics (sigmaaldrich.com)